摘要：为了提高生物质秸秆降解速度，筛选高效生物质纤维素降解菌系。本文章以富含玉米秸秆的腐烂物为菌源，用纤维素刚果红选择性培养基进行初筛，从中分离高效纤维素降解菌。初筛由刚果红培养基上透明圈直径大小以及滤纸条崩解能力初步判定；复筛则通过酶活的测定，包括滤纸条酶活的测定、羧甲基纤维素酶活的测定进行逐级筛选，从而组建高效菌株复合菌系。试验结果表明，从腐烂的玉米秸秆中筛选到一组玉米秸秆降解复合菌系，其C1菌株滤纸酶活相比最高，为8.52U/mL；N1菌株的纤维素酶活最高，为6.44U/mL。通过对所筛选的菌株复合菌系进行测序鉴定结果发现，复合菌系优势菌系主要组成是栓菌（Trametes）、稻瘟病菌（Sarocladium）、链霉菌（Streptomyces）、未分类的放线菌（Actinomycetales unclassified）、丙酸杆菌（Propionibacterium）。
关键词：复合菌；木质纤维素；筛选；菌群；降解
中图分类号：Q939
Screening of lignocellulosic degradation complex strains
SUN Miao-miao1, LI Juan2, LIU Guoqing*3, Zhou Chunyang4
(1 School of Food and Bioengineering, Hefei University of Technology, Hefei 230601, China；2 School of Food and Bioengineering, Hefei University of Technology, Xuancheng,242000, China；3 School of Food and Bioengineering, Hefei University of Technology, Hefei 230601, China；4 Cooking Teaching and Research Office of the First Logistics Training Base of the Air Force Shanghai 200443China)
Abstract：In order to improve the degradation rate of biomass straw and screen high-efficiency biomass cellulose degrading bacteria . In this article,the corn stalk-rich rot is used as a bacterial source, and the cellulose-congo red selective medium is used for preliminary screening to separate high-efficiency cellulose-degrading bacteria. The initial screening is determined by the diameter of the transparent ring on the Congo red medium and the disintegration ability of the filter paper strip; the rescreening is carried out by the determination of the enzyme activity, including the determination of the activity of the filter paper strip and the determination of the activity of the carboxymethylcellulose enzyme. Screening step by step to form a complex strain of high-efficiency strains. The results show that a group of corn stalk degradation complex strains were screened from the decayed corn stalks and in the enzyme activity assay, the C 1 strain had the highest filter paper activity of 8.52 U/mL;the N 1 strain had the highest cellulase activity of 6.44 U/mL. By sequencing and identifying the strains of the selected strains,The dominant strains of composite bacteria are Trametes, Sarocladium, Streptomyces, Actinomycetales unclassified, Propionibacterium。
Keyword:compound bacteria; lignocellulose; screening; flora; degradation
随着木质纤维素生物降解机理研究的不断深入，在生物降解过程中微生物间的协同关系也逐渐受到人们的重视,虽然纤维素的生物降解已研究了很长时间,但在为了提高木质纤维素的降解效率,不同领域的研究学者已经做了大量的科研工作,近年来研究发现，木质纤维素降解需要经过两种或更多种微生物的组合来完成，单一的微生物却只能发挥低弱的作用甚至没有作用[1]。因此，人们越来越关注微生物混合培养或混合发酵，如Haruta[2]等富集筛选得到一组能够有效降解稻草的复合菌系，该菌系在第4 d时稻草降解率达60%。Wongwilaiwalin[3]等得到一组能够有效降解工业蔗渣、稻草、工业桉树纸浆的高温纤维素降解复合菌群。目前国内也有许多学者致力于木质纤维素降解复合菌系的研究，杜然[4]构建一个降解纤维素的兼性厌氧复合菌系培养72 h可使滤纸失重90%，且发酵三天乙醇积累浓度可达1.54 g/L。刘爽[5]构建的复合菌系在216 h内稻草降解率达到75%。崔宗均[6]等以4种高温堆肥为原料构建了一组高效稳定的纤维素分解菌复合系MC1, 该复合系8 d可将水稻秸秆完全降解。王伟东[7]通过限制性培养技术获得了一组50 ℃静置条件下培养的木质纤维素快速降解复合菌系，培养3 d内滤纸完全降解。利用类似的方法，秦莉[8]、张庆华[9]、李维华[10]等也获得到具有木质纤维素降解能力的复合菌系，均表现出较好的降解效果。
因此，能够筛选能够降解纤维素的高效复合菌，用于木质纤维素降解的复合菌株的使用已成为当前研究的热点[11-12]。
本研究以腐烂的秸秆为主要原料，利用纤维素刚果红培养基分离纯化菌系，通过羧甲基纤维素酶活性的测定、滤纸条的降解实验、菌株的复筛（滤纸条酶活、CMCase酶活测定）来选出高效微生物群系构建复合菌系来构建复合菌系，并进行传代培养，选出高效微生物群系，之后进行筛选检测，确定微生物群系的组成。
1实验材料与方法
1.1样品来源
宣城市宣州区合肥工业大学周边田地里腐烂的玉米秸秆
1.2实验药品与试剂
（1）DNS试剂。酒石酸钾钠18.2g，溶于50mL蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸0.63g，NaOH2.1g，苯酚0.5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至100ml，贮于棕色瓶中7天室温保存。
（2）pH4.8柠檬酸缓冲液（0.05mol/L）。分别称取10.51克柠檬酸、14.71克柠檬酸钠，各自定容至500mL，即为0.1mol/L的柠檬酸和柠檬酸钠溶液。取柠檬酸溶液和柠檬酸钠溶液各11.5mL，混匀后加入蒸馏水至50mL，即为0.05 mol/L的pH值为4.8的柠檬酸缓冲溶液。
（3）0.51%的CMC-Na溶液。称取0.51g CMC，添加适量的0.05mol/L的柠檬酸缓冲溶液，加热溶解定容至100mL，用前充分摇匀。
（4）葡萄糖标准溶液（1mg/mL）。称取1克葡萄糖，加入蒸馏水定容至1L，即为1mg/mL的葡萄糖标准溶液。
1.3培养基
（1）纤维素刚果红培养基。CMC-Na2.0 g/L，(NH4)2SO42.0g/L，NaCl0.5g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，刚果红0.4g/L，琼脂12g/L，pH7.0
（2）滤纸条崩解培养基 [13]。
(NH4)2SO41.0g/L，MgS04·7H2O0.5g/L，KH2PO41.0g/L，酵母膏0.1g/L，滤纸条(1cm×6cm)1条/试管，pH7.0
（3）羧甲基纤维素钠培养基。CMC-Na10g/L，蛋白胨2g/L，NaCl0.5g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，酵母膏0.5g/L，琼脂20g/L，pH7.0
（4）发酵产酶培养基[14]。玉米秸秆粉20 g，NH4NO34g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O 0.5g，无水CaCl20.4g，NaCl0.5g，蒸馏水1000mL，pH6.0
（5）CMC-Na固体培养基。CMC-Na15g，NH4NO31.0g，酵母膏1.0g，MgSO4·7H2O0.5g，KH2PO41.0g，蒸馏水1000mL，加入琼脂20g
（6）PDA培养基。马铃薯浸汁（20%）100mL，琼脂2g，葡萄糖2g，pH自然
（7）高氏合成1号培养基。可溶性淀粉2.0g，KNO30.1g，K2HPO4·3H2O0.05g，FeSO4·7H2O0.001g，NaCl0.05g，MgS04·7H2O0.05 g, pH7.2~7.4琼脂1.5~2g，蒸馏水100mL
（8）肉汤培养基。牛肉膏0.5g，NaCl0.5g，蛋白胨1.0g，蒸馏水100mL，琼脂2g，pH值为7.2~7.4
1.4主要仪器
电热鼓风干燥箱DHG-9145A，上海一恒科技有限公司；数显恒温水浴锅HH-4，金坛市杰瑞尔电器有限公司；722型可见光分光光度计752N，上海仪电分析仪器有限公司；pH计PHS-25，上海仪电科学仪器股份有限公司；高速离心机JW-3021H，赛默飞世尔科技有限公司；数显气浴恒温振荡器THZ-82A，常州市金坛科兴仪器厂；生物显微镜BM1000，南京江南永新光学有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅YXQ-LS-50S11，上海博讯实业有限公司；电热恒温培养箱DHP-9082，上海一恒科学仪器有限公司；中药材高速粉碎机FD-15-T-500A，上海市闵行区舰艇工贸有限公司。
1.5试验方案设计
1.5.1样品的处理与初筛
(1) 样品处理。准确称取秸秆样品 10.0g，加入到一个盛有90mL的无菌生理盐水并且带有玻璃珠的250mL三角瓶中，于37 ℃恒温摇床摇动，将样品充分混匀打散3个小时备用。
(2) 初筛纯化。首先，将采集的样品用无菌水逐级10倍稀释至10-6、10-7和10-8倍后，分别取0.1mL涂布于纤维素刚果红选择性培养基上，每个浓度重复涂布3个平板，28℃下培养，定期观察，挑取菌落周围出现清晰透明圈的菌株；然后，通过划线分离纯化所挑取的菌株，直至得到单菌落。
1,5.2羧甲基纤维素酶活性的测定实验设计
（1）将纯化后的菌株进行筛选，选择生长状况较为良好的菌株，初步根据显微镜下形态观察确定菌株的种属。
（2）将霉菌和放线菌制成菌悬液分别涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基和高氏一号培养基上，其中待霉菌菌落和放线菌菌落长出后，用打孔器打6 mm得菌饼接种于纤维素刚果红平板而细菌则直接采取点接的方式接种于纤维素刚果红培养基上，在28℃恒温培养箱中培养 3-5d，观察并测量透明圈的直径大小；酶活高低的判断则通过透明圈直径大小（D）与菌落直径大小（d）的比值来进行初步判断。
1.5.3滤纸条崩解的实验设计
将筛选出的具有高CMCase活性的菌株进行活化，分别取用1mL接种于装有20mL的滤纸条崩解培养基的试管中（每根试管中放入2条滤纸条(/1*6cm），培养10-12d，定期观察滤纸条崩解情况[15]。
1.5.4菌株的复筛
1.5.4.1葡萄糖标准曲线的制作
取用8支洁净的具塞试管进行编号，并按照下表所要求的依次加入溶液，绘制葡萄糖标准曲线。
分别取葡萄糖标准液（1mg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL于20mL试管中，之后蒸馏水将每支试管补加至2.0mL,将蒸馏水与标准葡萄糖标准液的混合溶液充分摇匀后，分别准确加入DNS试剂2.0mL，摇匀后沸水浴加热5min，流水冷却，用水补足到20mL刻度。在540nm波长下测定吸光度，以第一支试管进行调零，并且以葡萄糖浓度含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
表1葡萄糖标准曲线的配制
Table 1 Configuration of the standard glucose curve
参数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
标准葡萄糖溶液（V/mL） | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | 1.2 | 1.4 |
蒸馏水（V/mL） | 2.0 | 1.8 | 1.6 | 1.4 | 1.2 | 1.0 | 0.8 | 0.6 |
葡萄糖含量（m/mg） | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | 1.2 | 1.4 |
1.5.4.2粗酶液的制备[16]
将通过挑选的的菌株制成菌悬液，分别取2mL菌悬液加入装有50mL发酵培养的150mL三角瓶中。30 ℃，160r/min，摇床培养3d，获得的培养液在离心机内8000r/min下离心15min。所获得的上清液就是粗酶液。
1.5.4.3酶活的测定[17]
（1）滤纸条酶活
取3根20mL的具塞试管，分别向其中加入0.5mL的粗酶液、1.5mL的柠檬酸缓冲液（0.05mol/L，pH4.8）,向第1支试管中加入2.0mLDNS试剂，摇匀并放入50 ℃水浴锅中预热 5min。各加入1*6cm滤纸条，摇匀，50 ℃反应 60min,取出后立即在2、3试管中加入2.0mLDNS试剂，摇匀，沸水浴5min。取出冷却至室温，摇匀。以第1支试管为空白，在540nm处测定吸光值。
（2）羧甲基纤维素酶活
取3根20mL的具塞试管，其中加入1.5mL的0.51% CMC柠檬酸缓冲液，各加入0.5mL酶液，向第1支试管中加入2.0mL DNS试剂，摇匀并放入50 ℃水浴锅中预热。50 ℃反应 30分钟。取出之后除第1支试管都加入2.0mL的DNS试剂终止酶反应。之后摇匀并沸水浴5min，取出冷却至室温，摇匀。以第1支试管为空白，在540nm处测定吸光值。酶活的单位与滤纸条酶活类似。
1.6菌株的鉴定
将挑选出来的菌株首先采用形态观察鉴定，之后根据它们的DNA序列和ITS序列比对进行鉴定。
（1）形态观察
a、采用划线分离，挑取单菌落划线于不同得培养基上，让各菌株在适宜生长温度下培养（细菌和放线菌28℃下培养，真菌在 30℃下进行培养），观察菌落的生长状况，并做好记录。
b、对生长良好的菌株进行镜检观察，观察其在显微镜下的形态特征，并拍照记录。
（2）序列比对鉴定
首先细菌和放线菌总DNA采用细菌基因组提取试剂盒提取，真菌总DNA采用真菌基因组提取试剂盒提取。
a、细菌16SrDNA序列扩增
采用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）与 806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物扩增细菌菌株16SrDNA序列。PCR反应体系：Phusion® HotStartFlex2XMasterMixartVersion：12.5uL、ForwardPrimer：2.5uL、ReversePrimer（2.5uL、模板DNA：50uL、加ddH2O 25uL。
PCR反应条件：预变性98℃，30s；变性98℃，10s，退火54℃，30s，延伸72℃，45s，35个循环；最后延伸72℃，10min；保持4℃。
将扩增后的DNA进行凝胶电泳检测，观察目的条带是否存在并符合要求。
b、真菌ITS2序列扩增
采用fITS7（5'-GTGARTCATCGAATCTTTG-3'）与ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）引物扩增真菌菌株 ITS序列。
PCR反应体系：Phusion® HotStartFlex2XMasterMixartVersion：12.5uL、ForwardPrimer2.5uL、ReversePrimer2.5uL、模板DNA：50uL、加ddH2O 25uL。
PCR反应条件：预变性98℃，30s；变性98℃，10s，退火54℃，30s，延伸72℃，45s，35个循环；最后延伸72℃，10min；保持4℃。
将扩增后的DNA进行凝胶电泳检测，观察目的条带是否存在并符合要求。
